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Biologie · Molekulare Genetik
Die Sequenzierung liest die Basenabfolge der DNA. Die Lektion erklärt den Kettenabbruch nach Sanger mit ddNTPs und den Unterschied zum Next-Generation-Sequencing.
Bei Sanger stoppt ein ddNTP die Synthese, und die Länge jedes Abbruchstücks verrät, welche Base dort sitzt. NGS liest Millionen Stücke gleichzeitig.
Die Polymerase verlängert eine Kette über die 3'-OH-Gruppe des letzten Nukleotids. Stell dir eine Perlenkette vor: Jede Perle hat hinten eine Öse für die nächste. Einem ddNTP (Didesoxynukleosidtriphosphat) fehlt diese 3'-OH-Gruppe. Wird es eingebaut, ist Schluss.
Weil nur wenig ddNTP im Ansatz ist, stoppt jede Kette an einer anderen Stelle. So entstehen Fragmente aller Längen. Wäre viel ddNTP da, würden fast alle Ketten sofort enden.
→ Ausführlich in: Genomanalyse (Gelelektrophorese)
Beispiel: Die Farben von kurz nach lang stehen für G, A, T, T, C. Der neue Strang ist 5'-GATTC-3', die Matrize 3'-CTAAG-5'. Das kürzeste Fragment trägt die Base direkt hinter dem Primer.
Nicht nötig sind RNA-Polymerase und Helikase. Die ältere Maxam-Gilbert-Methode spaltet die DNA chemisch und wird kaum noch benutzt.
Bei NGS wird die DNA in kurze Stücke zerlegt und werden Millionen davon gleichzeitig gelesen. Ein Computer setzt die Lesestücke zum Genom zusammen. Ein ganzes Genom dauert so nur Stunden bis Tage und kostet viel weniger.
| Sanger | NGS | |
|---|---|---|
| Lesestücke | eins pro Reaktion | Millionen parallel |
| Einsatz | einzelne Gene prüfen | Genom, Exom, Tumor |
| Daten | wenig | riesig, Auswertung am Computer |
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Deine AufgabeVergleiche dNTP und ddNTP: Welche Gruppe fehlt dem ddNTP, und warum entstehen dadurch Fragmente aller Längen?
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