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Die DNA-Sequenzierung ist ein biotechnologisches Verfahren zur Bestimmung der exakten Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül, wobei die Sanger-Methode durch gezielten Kettenabbruch die Grundlage bildet.
Nachdem wir gelernt haben, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA-Abschnitte milliardenfach vervielfältigt, stellt sich die Frage, wie wir die Information in diesen Abschnitten lesen können. Die DNA-Sequenzierung ist die Methode der Wahl, um die genaue Reihenfolge der Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin zu bestimmen.
Das klassische Verfahren ist die Sanger-Sequenzierung, auch bekannt als Kettenabbruchmethode. Sie nutzt ein cleveres chemisches Hindernis: Neben den normalen Bausteinen (dNTPs) werden spezielle Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTPs) hinzugefügt. Diesen ddNTPs fehlt am 3'-Kohlenstoffatom des Zuckers die Hydroxygruppe (-OH), die für die Bindung des nächsten Nukleotids zwingend erforderlich ist.
Stellen Sie sich die DNA-Synthese wie eine Perlenkette vor. Ein normales Nukleotid hat zwei Ösen (5' und 3'), um mit dem Vorgänger und dem Nachfolger verbunden zu werden. Ein ddNTP hat jedoch nur die vordere Öse (5'), aber keine hintere (3'). Sobald die DNA-Polymerase ein solches ddNTP einbaut, bricht die Synthese des Stranges sofort ab. Da ddNTPs nur in geringer Konzentration beigemischt werden, entstehen statistisch gesehen Fragmente aller möglichen Längen.
Für die Reaktion werden ein DNA-Einzelstrang als Matrize, ein spezifischer Primer (Startmolekül), DNA-Polymerase, freie dNTPs und die markierten ddNTPs benötigt. In modernen Geräten ist jedes der vier ddNTPs (für A, C, G und T) mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert, sodass das Ende jedes Fragments farblich codiert ist.
Die entstandenen DNA-Fragmente werden anschließend nach ihrer Größe sortiert. Dies geschieht meist durch eine Kapillarelektrophorese, bei der die kleinsten (kürzesten) Fragmente am schnellsten wandern. Ein Laser detektiert am Ende der Kapillare die Farbsignale. Die zeitliche Abfolge der Farben ergibt direkt die Sequenz des neu synthetisierten DNA-Stranges.
Eine wichtige Anwendung der Sequenzierung und PCR ist der genetische Fingerabdruck. Hierbei werden nicht ganze Gene sequenziert, sondern die Anzahl von Wiederholungen in nicht-codierenden Bereichen untersucht, den sogenannten Short Tandem Repeats (STRs). Da die Anzahl dieser Wiederholungen zwischen Individuen stark variiert, entsteht ein einzigartiges Muster.
Während die Sanger-Methode ideal für einzelne Gene ist, ermöglichen moderne Next-Generation-Sequencing (NGS)-Verfahren das gleichzeitige Lesen von Millionen von Fragmenten. Dies erlaubt die Sequenzierung eines gesamten menschlichen Genoms in kürzester Zeit, was die personalisierte Medizin und die Krebsdiagnostik revolutioniert hat.
