Biologie · Molekulare Genetik

PCR

Die PCR vervielfältigt einen gewählten DNA-Abschnitt in drei Temperaturschritten pro Zyklus. Die Lektion erklärt die Zutaten, die Taq-Polymerase und die Rechnung 2ⁿ.

Erklärtext

Polarstern

Die PCR kopiert einen gewählten DNA-Abschnitt im Reagenzglas (*in vitro*). Jeder Zyklus verdoppelt ihn: Nach n Zyklen sind es 2ⁿ Kopien.

Was ins Röhrchen kommt

Matrizen-DNA: enthält den Zielabschnitt.
Zwei Primer: kurze DNA-Startstücke. Einer sitzt am Anfang, einer am Ende des Zielabschnitts und legt fest, was kopiert wird.
Taq-Polymerase: hitzestabile DNA-Polymerase aus dem Bakterium *Thermus aquaticus*.
dNTPs: die freien Nukleotide als Baumaterial.
Puffer mit Mg²⁺-Ionen.

Nicht dabei: Helikase, Primase und Ligase. Die Hitze trennt die Stränge, und die Primer kommen fertig ins Röhrchen.

Ein Zyklus in drei Schritten

95 °CDenaturierung. Die Wasserstoffbrücken brechen, die Doppelhelix zerfällt in Einzelstränge. Das ersetzt die Helikase.
50–65 °CAnnealing. Die Primer lagern sich an ihre komplementären Stellen an. Zu heiß, und sie halten nicht; zu kalt, und sie binden auch an falsche Stellen.

Übungsfragen

72 °C

Elongation. Die Taq-Polymerase hängt dNTPs an das 3'-Ende der Primer und baut so den Gegenstrang in 5'→3'-Richtung.

Dieser Zyklus läuft etwa 25- bis 40-mal. Die Taq-Polymerase übersteht die 95 °C, eine menschliche Polymerase würde ihre Struktur verlieren. Dafür hat sie kein Proofreading (keine 3'→5'-Exonukleaseaktivität) und macht mehr Fehler als die Polymerase der Zelle.

Wie schnell es wächst

N = N₀ · 2ⁿN₀ = Startmoleküle, n = Zyklen; idealisiert, jedes Molekül verdoppelt sich

Aus einem Doppelstrang werden nach 1, 2, 3, 4 Zyklen 2, 4, 8, 16 Kopien. Nach 30 Zyklen sind es 2³⁰ ≈ 1,07 Milliarden. In echt bremst die Reaktion irgendwann ab (Plateau), weil Primer und dNTPs verbraucht sind.

Wofür man die PCR nutzt

Erreger nachweisen, auch aus winzigen Proben.
Erbkrankheiten und Mutationen testen.
Spuren am Tatort vervielfältigen. → Ausführlich in: Genetischer Fingerabdruck
Abschnitte vor dem Lesen vermehren. → Ausführlich in: DNA-Sequenzierung
RT-PCR: schreibt zuerst RNA mit der Reversen Transkriptase in cDNA um und kopiert dann. So weist man RNA-Viren nach.
qPCR: misst per Fluoreszenz schon während der Zyklen, wie viel DNA entsteht.

MedAT-Fallen

PCR vervielfältigt, Sanger liest. Die Basenfolge bestimmt erst die Sequenzierung.
Primer binden im Annealing, nicht in der Elongation. Die Reihenfolge ist Denaturierung, Annealing, Elongation.
Taq ist hitzestabil, aber ungenau. Sie hat kein Proofreading.

Beschriftbare Abbildung

PCR: drei Phasen in einer Übersicht

Symbole

Deine AufgabeKlicke auf die drei Phasen des PCR-Zyklus und den Reaktionsansatz: Welche Temperaturen sind jeweils nötig? In welche Richtung synthetisiert die Taq-Polymerase?

Tippe auf eine Beschriftung in der Abbildung, um ihre Erklärung zu lesen.

Ein einziges anklickbares Diagramm sammelt Denaturierung, Primerbindung und Verlängerung. Die antiparallelen Matrizen und nach innen gerichteten Primer bestimmen die Synthese in 5′→3′-Richtung. Temperaturen sind typische Näherungen für eine Taq-PCR und hängen vom Ansatz ab. N = N₀·2ⁿ ist das ideale Verdopplungsmodell, keine Garantie einer realen Reaktion.

Interaktive Darstellung

Exponentielle Kopienvermehrung in der PCR

Deine AufgabeStelle die Zyklenzahl n ein und lies im Diagrammrecht die Kopienzahl K = 2ⁿ ab; schätze die Anreicherung nach 30 Zyklen ab.

Darstellung wird geladen …

Das Produkt jedes Zyklus dient als Matrize für den nächsten: Die Kopienzahl verdoppelt sich pro Zyklus, also K = 2ⁿ für n Zyklen. Nach 30 Zyklen sind theoretisch über eine Milliarde Kopien entstanden — verschiebe die Zyklenzahl n und lies die Kopienzahl ab.